El Rey le nombró en 1513 gobernador y Capitán General del Darién, que a partir de entonces pasó a denominarse Castilla del Oro. Zarpó con su flota desde Sanlúcar de Barrameda el 11 de abril de 1514 al frente de una gran expedición, compuesta por 30 navíos y alrededor de 2.300 personas, llevando como piloto a Florentino Vespucio, y entre sus hombres, muchos que a la postre serian grandes exploradores y conquistadores, los mas destacados; Diego de Almagro, Sebastián de Belalcázar, Bernal Díaz del Castillo, Pascual de Andagoya, Gonzalo Fernández de Oviedo, Hernando de Soto, Hernando de Luque, Francisco de Montejo, Rodrigo Enríquez de Colmenares, Martín Fernández de Enciso, Francisco de Jerez y Fray Juan de Quevedo, el primer obispo del nuevo territorio que se pretendía colonizar.

A finales de julio llegó a las costas del Darién, donde gobernaba interinamente Vasco Núñez de Balboa, pasaron malos momentos debido al clima que produjo efectos en los colonizadores, teniendo que soportar hambre y enfermedades. En 1516 Pedrarias envió a sus capitanes Hernán Ponce y Bartolomé Hurtado a explorar los territorios vecinos, las costas de Nicaragua y Costa Rica. El mismo Pedrarias dirigió una campaña contra los indígenas de la zona, a los que no pudo vencer. Fundó Santa María la Antigua del Darién, la ciudad de Acla, el segundo asentamiento español en Tierra Firme. Para explorar el mar del Sur, en 1516 Pedrarias formó una sociedad con Núñez de Balboa, que se había casado con una hija suya. Entre ambos hubo desavenencias, que terminó con la muerte de Vasco Núñez de Balboa, en 1519. Por sus actuaciones, el Rey Carlos I nombró gobernador del territorio a Lope de Sosa en 1519, pero murió pronto antes de tomar posesión de su cargo.

Pedrarias volvió a ser gobernador, en 1519 fundó Nuestra Señora de la Asunción de Panamá (la actual ciudad de Panamá). En 1522 ayudó a la expedición de Gil González y Andrés Niño, que habían partido de Sanlúcar en 1519 en busca de un paso hacia el Pacífico. Con posterioridad envió a Francisco Fernández de Córdoba a entrevistarse con Hernán Cortés, que desde Méjico había llegado a aquellas tierras. Enterado Pedrarias, en 1526 viajó hasta Nicaragua, y pudo entrevistarse con Fernández de Córdoba, quien no le aclaró lo que pactó con Cortés, por su deslealtad, ordenó ajusticiarlo. Pedrarias fue sustituido por Pedro de los Ríos, pero se las compuso para ser nombrado gobernador de Nicaragua y Capitán General de aquella zona, por haber muerto Gil González. Fundó las ciudades de Villahermosa, León, Granada, etc., falleció en 1530. Escribió en 1529 una relación de los descubrimientos que se habían hecho en el mar del sur, desde la villa de Bruselas hasta el golfo de San Lucas.